เทคนิคการตรวจวิเคราะห์ดีเอ็นเอจากอาหารที่ได้จากเนื้อสัตว์

 สิ่งมีชีวิตทุกชนิดมีความแตกต่างกัน เนื่องมาจากการที่สิ่งมีชีวิตมีสายพันธุกรรมที่เรียกว่าดีเอ็นเอแตกต่างกัน ซึ่งความแตกต่างของดีเอ็นเอในที่นี้หมายถึง ชนิดและการเรียงตัวลำดับเบส รวมทั้งความยาวของดีเอ็นเอที่แตกต่างกัน จึงทำให้เกิดความแตกต่างและความหลากหลายของสิ่งมีชีวิต ซึ่งสามารถใช้ความแตกต่างนี้ เป็นตัวแยกสิ่งมีชีวิตแต่ละสปีชีส์ออกจากกันได้

                 การจำแนกสปีชีส์ของเนื้อสัตว์จากอาหาร หรือผลิตภัณฑ์ที่ได้จากเนื้อสัตว์นั้นได้ถูกพัฒนาเป็นลำดับ เนื่องจากกระบวนการผลิตอาหารปัจจุบันมีความซับซ้อนมากยิ่งขึ้นโดยเฉพาะในกรณีของเนื้อสัตว์มักมีปัญหาที่ซับซ้อนกว่าอาหารฮาลาลกลุ่มอื่นๆ เพราะมักเกิดเหตุการณ์เนื้อฮาลาลสัมผัสกับเนื้อไม่ฮาลาลอยู่เสมอ หรือการติดฉลากที่ไม่ตรงกับความเป็นจริง การตรวจวิเคราะห์การปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์อาหารจากเนื้อสัตว์ที่สำคัญที่สุดคือการวิเคราะห์การวิเคราะห์การปนเปื้อนจากเนื้อสุกร ซึ่งเป็นสิ่งต้องห้ามทางศาสนาและมีโอกาสปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์อาหารมากที่สุด

              ดังนั้น วิธีการตรวจวิเคราะห์จึงได้ถูกพัฒนาขึ้นอย่างต่อเนื่อง การตรวจวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์จากเนื้อสัตว์เริ่มแรกจะใช้เทคนิคทางภูมิคุ้มกันวิทยา ซึ่งสามารถตรวจวิเคราะห์อาหารดิบที่ยังไม่ผ่านการปรุง ได้แก่ ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) สามารถตรวจวิเคราะห์เนื้อสุกรปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์อาหารได้ แต่ความไวจะลดต่ำลงสำหรับอาหารที่ปรุงสุกหรืออาหารที่ผ่านกระบวนการหลายขั้นตอนเนื่องจากโปรตีนถูกทำลาย

   ต่อมาได้มีการพัฒนาใช้ดีเอ็นเอเป็นแหล่งตรวจวัด โดยเริ่มแรกใช้เทคนิค DNA hybridization เทคนิคนี้เป็นการค้นหาดีเอ็นเอต้นแบบที่ต้องการจากกลุ่มลำดับเบสที่แตกต่างกันจำนวนมาก โดยใช้ดีเอ็นเอสายเดี่ยวที่ถูกติดฉลากด้วยสารรังสีหรือสารเรื่องแสงเพื่อเป็นโพรบ (Prob) จับคู่กับดีเอ็นเอต้นแบบที่ติดอยู่บนเมมเบรน ด้วยวิธี Slot blot หรือ Dot blot ภายใต้สภาวะที่เหมาะสมสามารถตรวจวัดในเชิงปริมาณ โดยวัดได้จากความเข้มข้นของสัญญาณที่ติดฉลากซึ่งยังอาจไม่นิยมใช้กันมากนักเนื่องจากใช้เวลานานในการติดฉลากโพรบ

                และต่อมาจึงมีการพัฒนามาใช้วิธีการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (Polymerase Chain Reaction หรือ PCR) ซึ่งมีความรวดเร็วกว่า และใช้ปริมาณสารตัวอย่างตั้งต้นเพียงเล็กน้อยมีความจำเพาะและมีความไวในการตรวจสูง เทคนิค PCR นี้เป็นเทคนิคที่ใช้เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอที่สนใจมีอยู่น้อยให้สามารถตรวจวัดได้

               หลักการพื้นฐานของ PCR จะให้โอลิโกนิวคลีโอไทด์ไพรเมอร์ (Oligonucleotide primers) หรือดีเอ็นเอสายสั้นๆ ของลำดับเบสคู่สมกันลายสาย DNA แม่แบบ ในการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่, เอนไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอเรส (DNA Polymerase) และอุณหภูมิที่ทำให้ดีเอ็นเอแยกจากกันหรือจับคู่กันใหม่ ซึ่งปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 3 ขั้นตอนคือ

ขั้นที่ 1 Denaturation  เป็นการแยกสายดีเอ็นเอต้นแบบจากสภาพที่เป็นสายคู่ให้เป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยวโดยใช้อุณหภูมิ 92-95 °C 

ขั้นที่ 2 Annealing เป็นขั้นตอนที่ทำให้โอลิโกนิวคลีโอไทด์ไพรเมอร์ที่มีลำดับเบสเป็นคู่สมกับดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบจับคู่กัน ซึ่งนิยม ใช้อุณหภูมิในช่วง 50-60 °C  

ขั้นที่ 3 Extension เป็นขั้นตอนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ โดยการสังเคราะห์ต่อจากส่วยปลาย 3’ ของไพรเมอร์ โดยอาศัยการทำงานของเอนไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอร์เรส (DNA polymerase) ซึ่งเอนไซม์นี้สามารถทำงานได้ดีที่สุดที่อุณหภูมิ 72-75  °C

            โดยจะทำการหมุนต่อเนื่องกันไปตั้งแต่ขั้นที่ 1-3 เป็นรอบๆ ทั้งหมด 30-50 รอบ ภายใต้สภาวะที่เหมาะสมของแต่ละขั้นตอนเมื่อเสร็จสิ้นสิ้นปฏิกิริยาจะเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมาย ได้เป็นจำนวนล้านเท่า สามารถตรวจสอบผลผลิตของดีเอ็นเอได้ จากการนำดีเอ็นเคลื่อนผ่านกระแสไฟฟ้าบนแผ่นวุ้น (Gelelectrophoresis) และนำมาย้อมดีเอ็นเอด้วยเอธิเดียมโบรไมด์เพื่อตรวจ วิเคราะห์แถบดีเอ็นเอ โดยผ่านเครื่องฉายแสงยูวี (UV transiluminator) ต่อไป (ปฏิกิริยา PCR แสดงดังรูป)

            Meyer R. และคณะได้ใช้เทคนิค PCR ในการตรวจวัดดีเอ็นเอจากเนื้อสุกร พบว่าสามารถตรวจวัดเนื้อสุกรผสมเนื้อวัวทั้งที่เป็นเนื้อดิบ และเนื้อที่ผ่านความร้อนที่ความเข้มข้นต่ำถึง 2 เปอร์เซนต์ในขณะที่ชุดตรวจด้วยวิธีทางภูมิคุ้มกันวิทยา (Immunology)ไม่สามารถตรวจวัดเนื้อที่ผ่านการปรุงสุกที่ความเข้มข้นต่ำกว่า 20เปอร์เซนต์ และเนื้อดิบที่ความเข้มข้นต่ำกว่า 10 เปอร์เซนต์ได้ Rodriguez และคณะใช้ PCR ในตรวจวิเคราะห์ เนื้อสุกร เนื้อวัวเนื้อแพะ และเนื้อแกะ สำหรับเนื้อดิบและเนื้อที่ผ่านการปรุงสุกในรูปเนื้อผสม สามารถตรวจวัดเนื้อผสมที่ขีดจำกัดต่ำสุด (detectionlimit) ที่ 1 เปอร์เซนต์

           การตรวจวิเคราะห์ด้วยเทคนิค PCR เป็นเทคนิคที่นิยมใช้ในการตรวจวัดเนื้อสุกรปนเปื้อนในเนื้อสัตว์ชนิดอื่นๆด้วย รวมทั้งใช้จำแนกสปีชีส์ของเนื้อสัตว์ชนิดต่างๆ ในอาหาร สามารถวิเคราะห์เนื้อสัตว์ทั้งที่เป็นเนื้อดิบ และเนื้อที่ผ่านการปรุงสุกมาแล้ว ซึ่งใช้ปริมาณตัวอย่างเพียงเล็กน้อย มีความรวดเร็ว มีความไว และความจำเพาะสูงอีกทั้งยังสามารถตรวจวัดในเชิงปริมาณที่เรียกว่าเทคนิค Real-Time PCR ได้อีกด้วย

…………………………………………………………………….
แหล่งที่มาศูนย์วิทยาศาสตร์ฮาลาล จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย.ดีเอ็นเอ และเทคนิคการตรวจวิเคราะห์ : ดีเอ็นเอจากอาหารที่ได้จากสัตว์.Halal Insigh เล่ม 3.มกราคม-มีนาคม 2551
หรืออ่านจากนี้ได้เลยครับhttp://www.halalscience.org/uploadfiles/halal_insight-edit.pdf%20vol3-DNA.pdf